Měření indukované fluorescence chlorofylu

Princip metody

Metoda využívá poznatku objeveného už ve třicátých letech 20. století (Kautsky and Hirsch 1934), že fotosyntetizující organismy obsahující chlorofyl a vyzařují určitou část zachycené světelné energie zpět ve formě fluorescenčního záření ve viditelné oblasti spektra (především červené až infračervené okolo 685 nm a 735 nm). Později byl tento fenomén vysvětlen jako součást systému mechanismů pro odvádění přebytečné energie získané ze zachycených fotonů.

Fluorescence molekul chlorofylu je čistě fyzikální jev, ve změnách intenzity vyzařované fluorescence se však odráží průběh fotochemických reakcí tzv. primární (světelné) fáze fotosyntézy: zachycení fotonů, excitace molekul chlorofylu a jejich energií a uvolnění energeticky obohacených elektronů, z nichž je energie předána a uložena do makroergních vazeb v molekulách ATP a NADPH₂ pro další využití.

Fluorescenční odezva je indukována krátkými pulsy slabého měřícího světla a je zaznamenávána pomocí citlivého detektoru. Ten je vybaven optickými filtry tak, aby do něj pronikaly právě jen záblesky indukovaného fluorescenčního záření o větších vlnových délkách. Na základě dynamiky změn intenzity fluorescence chlorofylu sledované v čase lze popsat změny na biochemické úrovni fotosyntetického aparátu rostliny, řasy nebo sinice a alespoň zhruba posoudit účinnost fotosyntézy u daného organismu. Fotosyntetický aparát fotoautotrofních organismů je velmi citlivý na změny podmínek prostředí, ať se jedná o faktory fyzikální (např. teplota, nadměrná ozářenost, UV-záření, sucho atd.) nebo chemické (přítomnost toxických organických sloučenin přirozených i umělých, např. herbicidů, dále vliv těžkých kovů, ozónu a dalších látek) nebo také deficience živin.

Výhodou této metody je, že měření je možné provést rychle, nedestruktivně a opakovaně, v laboratoři i v terénu. S úspěchem se využívá ve stresové fyziologii rostlin při studiu vlivu výše zmíněných faktorů. Za nevýhodu lze považovat často zaznamenání stejné, nespecifické reakce na různé typy stresových podnětů. To omezuje možnost využítí fluorescence chlorofylu jako přímého důkazu působení specifického faktoru, zejména při možném spolupůsobení více faktorů.

Indukovaná fluorescence chlorofylu na CCT

Na našem pracovišti využíváme fluorescenční kameru FluorCam MF700 od brněnské firmy Photon System Instruments ve dvojím provedení: kamera se zatemněnou měřící komorou na makro objekty a kamera vestavěná v mikroskopu pro studium nativních mikropreparátů. Vestavěné zdroje měřicího, aktinického a saturačního světla spolu s ovládacím softwarem (FluorCam v.5 a v.6) umožňují používat je jako fluorimetry typu PAM (pulzní amplitudová modulace, např. Roháček and Barták 1999). Jejich pomocí lze měřit řadu parametrů při tzv. Kautského efektu (ozáření vzorku adaptovaného na tmu stálým světlem) nebo vyhodnocovat změny v podílu fotochemického a nefotochemického využití excitační energie metodou saturačních pulsů (kromě měřícího a stálého aktinického světla je vzorek souběžně ozařován i krátkými pulsy velmi silného světla, které způsobí krátkodobé a zvratné zahlcení fotosyntetického aparátu excitační energií a umožní tak zhodnotit jeho kapacitu pro přenos této energie).

Obě kamery jsou běžně využívány pro rychlé hodnocení fotosyntetické aktivity přírodních i laboratorních suspenzí fytoplanktonu jako doplňková metoda při experimentální práci na oddělení.

Kautsky, H., Hirsch, A. 1934. Chlorophyllfluoreszenz und Kohlensäureassimilation. Das Fluoreszenzverhalten grüner Pflanzen. Biochem. Zeitschrift 274: 423-434.
Roháček, K., Barták, M. 1999: Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters, and some applications. Photosynthetica 37(3): 339-363.