Mikroskopické techniky

Mikroskopie na CCT

Na našem pracovišti využíváme techniky světelné mikroskopie jak klasické s použitím Nomarského kontrastu, tak mikroskopie fluorescenční za účelem taxonomických analýz vzorků a stanovení celkových počtů bakteriálních buněk či virových částic ve vodě a sedimentech. Mikroskopické analýzy jsou prováděny na mikroskopu Olympus BX-60 (0lympus Corp.) vybaveném fluorescenčními kostkami s filtry umožňujícími sledování objektů vykazujících autofluorescenci chlorofylu-a a také objektů barvených např. pomocí  DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindol), SYBR Gold, SYBR Green I (Molecular Probes Inc.), CTC (5-cyano-2,3-di-(p-tolyl)tetrazolium chlorid). Barvení specifickými fluorochromy umožňuje kvantifikaci bakteriálních buněk nebo virových částic v přírodních vzorcích díky afinitě fluorochromů k nukleovým kyselinám (barvení DAPI, SYBR Gold, SYBR Green I - Noble and Fuhrman 1998, Porter and Feig 1980, Wen et al. 2004) nebo kvantifikaci aktivní frakce bakterií ve vzorku na základě redukce CTC na fluoreskující formazan (Rodriguez et al. 1992). Dále jsou ke studiu mikrobiálních společenstev ve vodě a sedimentu pomocí mikroskopie a průtokové cytometrie využívány substráty FDA (fluorescein diacetát) a propidium jodid, díky nimž lze stanovit enzymovou aktivitu a životaschopnost mikroorganismů. Mikroskop je dále vybaven chlazenou digitální kamerou DP 70 (12,5 mil. pixelů; 0lympus Corp.) napojenou na počítač se softwarem analýzy obrazu Cell D (0lympus Corp.), což umožňuje základní práci s digitálním obrazem.

Noble, R.T., Fuhrman, J.A. (1998): Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquatic Microbial Ecology 14: 113-118.
Porter, K.G., Feig, Y.S. (1980): The use of DAPI for identifying and counting aquatic microflora. Limnology and Oceanography 25: 943-948.
Rodriguez, G.G., Phipps, D., Ishiguro, K., Ridgway, H.F. (1992): Use of a fluorescent redox probe for direct visualization of actively respiring bacteria. Applied and Environmental Microbiology 58: 1801-1808.
Wen, K., Ortmann, A.C., Suttle, C.A. (2004): Accurate estimation of viral abundance by epifluorescence microscopy. Applied and Environmental Microbiology 70: 3862-3867.