Průtoková cytometrie

Princip metody

Průtoková cytometrie umožňuje diferenciaci populací buněk a zjištění přesných počtů buněk obsažených v suspenzi vzorku na základě jejich různých optických vlastností. Metoda byla sice primárně vyvinuta pro buňky živočišného původu, s úspěchem ji však lze využít také pro analýzu fytoplanktonu ve vzorcích z vodního prostředí. Metoda využívá jednak rozptylu světla (přímý a boční rozptyl) a jednak fluorescence jednotlivých buněk. Zatímco buňky fytoplanktonu mají tu výhodu, že obsahují fluoreskující pigmenty (tj. chlorofyl zelených řas a fykoerythrin či fykocyanin sinic) a vykazují tedy tzv. autofluorescenci, jiné typy buněk či nebuněčných struktur (bakterie, viry) tyto pigmenty neobsahují, mohou však být značeny pomocí fluorescenčních substrátů, které se nejčastěji váží na jejich DNA.

Průtoková cytometrie na CCT

Na našem pracovišti používáme k analýze vzorků z vodního prostředí přístroj CyFlow ML (Partec GmbH, Münster, Německo). Přístroj je vybaven 4 excitačními zdroji - modrým laserem (488 nm/20 mW), zeleným laserem (532 nm/30 mW), červeným diodovým laserem (635 nm/25 mW) a UV diodou (365 nm) a 4 optickými parametry (FSC_{488 nm}, SSC_{488 nm}, FL1 a FL2). K dispozici máme v současné době 5 optických filtrů (527/30 nm - SYBR Green I, fluorescein, ELF aj.; 590/50 nm - fykoerythrin; 675/20 nm - chlorofyl; 630 LP a 450/50 nm - DAPI, Hoechst), celý systém je však modulární a umožňuje rozšíření o další optické parametry. Výhodou oproti průtokovým cytometrům jiných firem (BD Biosciences, Beckman Coulter) je možnost stanovení koncentrací jednotlivých buněk ve vzorku bez použití referenčních částic díky režimu tzv. volumetrického počítání.

Průtokový cytometr CyFlow ML je využíván zejména k detekci fytoplanktonu v terénních vzorcích a k provádění testů toxicity na laboratorních kulturách fytoplanktonu. Vedle zjišťování celkových počtů buněk jednotlivých populací fytoplanktonu je měřena také jejich metabolická aktivita pomocí fluoresceindiacetátu (FDA). Přístroj dále slouží ke zjišťování počtů bakterií ve vodách (barvení pomocí SYBR Green I) a k detekci viability bakterií (duální barvení SYBR Green I + propidium- jodid) a fytoplanktonu (SYTOX Green). V blízké budoucnosti bychom chtěli optimalizovat metodické postupy pro extrakci bakterií a sinic ze sedimentů vod, měřit respirační aktivitu bakterií pomocí CTC a měřit aktivitu extracellulárních fosfatáz pomocí ELF-97.

V neposlední řadě je na našem pracovišti průtoková cytometrie využívána ke studiu účinků cyanotoxinů na buněčných liniích. V současnosti studujeme vliv expozice HaCat buněk (keratinocytů) různými druhy toxinů na buněčný cyklus exponovaných buněk. Buňky fixované ethanolem jsou barveny pomocí propidium jodidu a procentuální zastoupení buněk v jednotlivých fázích buněčného cyklu je vyhodnocováno cytometricky (obr. 5).

Obr. 1)  Měření metabolické (esterázové) aktivity sinic Microcystis aeruginosa. Kinetika hydrolytického štěpení fluorescein diacetátu (FDA) na fluorescein během inkubace o délce cca 10 minut. Zatímco autofluorescence sinic zůstává po celou dobu inkubace stejná (obr. vlevo), zelená fluorescence buněk stoupá v důsledku aktivity esteráz cyanobakterií (obr. vpravo).  

 
Obr. 2) Stanovení celkových počtů bakterií E. coli ve vodě filtrované přes různé druhy materiálů. Počet bakterií ve vzorku byl stanoven po jeho obarvení barvivem SYBR Green I. Bakterie byly ohraničeny v regionu  "total E. coli". V rámci tohoto regionu se podařilo detekovat 2 subpopulace bakterií lišící se obsahem nukleových kyselin (LNA - bakterie s nízkým obsahem nukleových kyselin, HNA - bakterie s vysokým obsahem nukleových kyselin). Filtrace vzorku (cytogram uprostřed resp. vpravo) vedla k významnému snížení počtu bakterií v porovnání s nefiltrovanou kontrolou (cytogram vlevo).

 
Obr. 3) Stanovení membránové integrity bakterií E. coli exponovaných ftalocyaninem pomocí duálního barvení SYBR Green I + propidium jodid. Bakterie s intaktní membránou lokalizovány v regionu "live", bakterie s porušenou membránou pak v regionu "dead". Expozice bakterií ftalocyaninem za současného působení světla  (graf D) vedla k nárůstu procentuálního zastoupení bakterií s porušenou membránou v porovnání s kontrolními neexponovanými skupinami (A - tma, B - světlo) i v porovnání se skupinou exponovanou ve tmě (graf C).

 
Obr. 4) Stanovení viability (membránové integrity) sinic Microcystis aeruginosa exponovaných peroxidem vodíku pomocí fluorescenčního barviva SYTOX Green. Buňky s intaktní buněčnou membránou lokalizovány v regionu SYTOX-, buňky s membránou porušenou v regionu SYTOX+. Zatímco po 7 hodinách expozice byla prakticky u všech buněk detekována intaktní buněčná membrána (obr. vlevo), po 24 hodinách (obr. uprostřed) resp. po 72 hodinách (obr. vpravo) se počet buněk s kompromitovanou buněčnou membránou  signifikantně zvyšoval. 

 
Obr. 5) Analýza buněčného cyklu HaCat keratinocytů pro studium účinků cyanotoxinů. Vlevo histogram kontrolního vzorku barveného propidium jodidem, vpravo tentýž histogram zpracovaný pomocí cytometrického softwaru. Buňky v G1 fázi buněčného cyklu tvoří výrazný peak v oblasti cca 200 označený modrou barvou, buňky v S fázi (s probíhající syntézou DNA) jsou označeny červeně. Zelený peak v oblasti kolem 400 je tvořen buňkami s duplikovaným obsahem jaderné DNA - tzv. G2/M fáze buněčného cyklu.