Využití nové fluorescenční sondy FluoroProbe pro stanovení množství fytoplanktonu in situ

Jakub Gregor & Blahoslav Maršálek 

Správná citace tohoto textu je:
Gregor J., Maršálek B. (2005) Využití nové fluorescenční sondy FluoroProbe pro stanovení množství fytoplanktonu in situ. Centrum pro cyanobakterie a jejich toxiny, http://www.sinice.cz/.
Děkujeme vám, že při jakémkoliv dalším využití těchto informací vždy uvedete jejich zdroj. 

Z hlediska velkých zdravotních rizik souvisejících s nadměrným rozvojem vodních květů sinic je stále důležitější vývoj metod pro jejich rychlou a přesnou kvantifikaci a zjištění jejich podílu na celkovém množství fytoplanktonu. V současné době je stanovení biomasy fytoplanktonu založeno především na stanovení chlorofylu a (extrakce do organického rozpouštědla a následné stanovení pomocí spektrofotometru, fluorometru nebo HPLC), které je doplněno mikroskopickým pozorováním zahrnujícím kvalitativní i kvantitativní (případně semikvantitativní) analýzu vzorku (např. v Bürkerově komůrce). Celý tento proces vyžaduje nejen standardizovanou metodiku odběru, ale i následné zpracování je poměrně zdlouhavé a náročné. Pro mikroskopickou analýzu je navíc potřeba odborníka pro určení zástupců jednotlivých skupin fytoplanktonu.

Během 90. let byla propracována možnost detekce fytoplanktonu pomocí in vivo flurescence chlorofylu a. Při každém dopadu světla na pigment periferní antény na fotosystému II (součást fotosyntetického aparátu autotrofních organismů) dojde k přenosu energie na chlorofyl a, což se projeví mj. i vyzářením světelného kvanta o vlnové délce kolem 685 nm. Tohoto jevu, který se nazývá fluorescence, lze využít nejen při kvantifikaci biomasy fytoplanktonu jako celku, ale i při odlišení jeho jednotlivých skupin. Jak již bylo zmíněno, fotosystém II je tvořen chlorofylem a a dalším pigmentem. Tyto pigmenty jsou specifické pro určité skupiny fytoplanktonu. Sinice tak obsahují fykobiliproteiny (fykocyanin, fykoerythrin), zelené řasy chlorofyl b/c a karotenoidy, rozsivky xantofyly atd. Z tohoto hlediska, které velice dobře kopíruje i taxonomické rozdělení, lze fytoplanktonní organismy rozdělit na několik skupin podle barvy pigmentů: "modrá" (sinice), "zelená" (zelené řasy), "hnědá" (hnědé řasy), "červená" (ruduchy) a "smíšená" (skrytěnky – Cryptophyta). Každá z těchto skupin má také pochopitelně jiné spektrum pro excitaci příslušných pigmentů a následnou fluorescenci chlorofylu a. Z tohoto předpokladu vychází i princip ponorné fluorescenční sondy FluoroProbe (bbe-Moldaenke, Kiel, Německo). Jedná se o přístroj, který je schopen na základě excitačních spekter organismů přítomných ve fytoplanktonu od sebe rozlišit sinice (Cyanobacteria), zelené řasy (Chlorophyta), hnědé řasy (Heterokontophyta, Dinophyta, Haptophyta) a skrytěnky (Cryptophyta) a v podobě množství chlorofylu a na litr určit jejich biomasu. 

Obr. 1: Sonda FluoroProbe. Vlastní přístroj je skrytý v černém tubusu, který slouží jako mechanická ochrana i jako štít proti nadměrnému slunečnímu záření, které může negativně ovlivnit výsledky měřené v horních vrstvách vodního sloupce. 

Přístroj je napojen na počítač se speciálním softwarem, který okamžitě vyhodnocuje naměřená data a udává množství sinic, řas, rozsivek a skrytěnek ve vodě v mikrogramech chlorofylu a na jeden litr. Vedle množství fytoplanktonu také poskytuje údaje o aktuální hloubce, teplotě vody a průhlednosti. Měření je prováděno obvykle v sekundových intervalech. Výsledky jsou zobrazovány v přehledné tabulce a následně i v grafu. Soubory z tohoto softwaru je možné převést do ASCII formátu a následně dále zpracovávat v jiných programech (MS Excel, Statistica apod.). Sondu lze v závislosti na délce kabelu spouštět do libovolné hloubky a během několika desítek sekund tak lze získat profil celého vodního sloupce. 

Obr. 2: Ukázka tabulky s daty ze sondy FluoroProbe. Zleva: čas, hloubka, teplota vody, zelené řasy, sinice, rozsivky, skrytěnky, celkový chlorofyl a, průhlednost, interní teplota přístroje. 

Obr. 3: Ukázka grafu ze sondy FluoroProbe. Na svislé ose hloubka, na vodorovné množství chlorofylu a. Zelená barva - zelené řasy, modrá barva - sinice, žlutá barva - rozsivky, hnědá barva - skrytěnky, bílá barva - celkový chlorofyl a. 

Využití FluoroProbe je velmi široké a zahrnuje prakticky všechny typy sladkých i slaných vod. Nicméně jako každý jiný přístroj má svá omezení. Jako ideální se zatím jeví pro vodárenské nádrže a obecně pro vodní tělesa s nízkým obsahem chlorofylu a. Výrobce uvádí detekční limit 1 ug/L. Na opačném pólu stojí naopak eutrofizované nádrže s vysoce rozvinutým vodním květem. Podle našich zkušeností především z Brněnské přehrady leží horní hranice při totální dominanci sinic kolem 50 ug/L. Nad touto hranicí je již koncentrace fytoplanktonu tak vysoká, že dochází ke značné reabsorpci emitovaného záření (chlorofyl a má absorpční maximum v 680 nm, tj. téměř ve stejné vlnové délce jako je jeho fluorescence) a díky tomu i podhodnocení skutečné hladiny chlorofylu a. FluoroProbe lze samozřejmě použít i k vzorkování říčních toků, zde je však třeba počítat s tím, že voda může být značně zakalená a tudíž negativně ovlivňovat přenost měření. Podle našich zkušeností je stanovení chlorofylu v řekách fluorescenční sondou zhruba poloviční oproti standardní metodě (extrakce etanolem a spektrofotometrická koncovka). V tomto případě je dobré udělat jakousi rekalibraci a výsledky získané ze sondy přepočítat. Na druhě straně je však třeba vzít v úvahu, že FluoroProbe je nakalibrována podle HPLC analýz, které prakticky vždy dávají nižší výsledky než metody založené na absorbanci nebo fluorescenci extrahovaného chlorofylu, což je většinou dáno interferencí ostatních pigmentů a rozkladných produktů chlorofylu a přítomných v extraktu.

Velká přednost sondy FluoroProbe spočívá především v obrovském množství dat získaném velice jednoduchou a rychlou cestou. Pro získání informací o výskytu fytoplanktonu v celém vodním sloupci standardními metodami bychom museli odebrat větší množství vzorků o objemu minimálně 1 litr, ty pak transportovat do laboratoře a provádět několikahodinové analýzy na stanovení chlorofylu a taxonomickou determinaci. S ponornou fluorescenční sondou lze tyto data získat během několika minut přímo na místě. Postačí odebrat jen několik vzorků pro rychlou kvalitativní analýzu pod mikroskopem a tou pak údaje z FluoroProbe doplnit.

Obrázky č. 4-6 ukazují několik typických vertikálních profilů vodního sloupce získaných touto sondou v období od jara do podzimu. 

Obr. 4: Typický vertikální profil získaný na jaře, kdy fytoplanktonu dominují zelené řasy a rozsivky. V hloubce zhruba 6 m dochází k výraznému poklesu teploty (šedé tečky) a s ním i k viditelnému poklesu množství fytoplanktonu. 

Obr. 5: Uprostřed léta naopak dochází k výraznému rozvoji vodních květů sinic, které fytoplanktonu zcela dominují (obzvláště v horních 4 m). Mezi nimi je ještě menší množství zelených řas, naopak rozsivky jsou již zcela vymýceny. 

Obr. 6: Na začátku října již mohutná biomasa sinic z velké části klesla ke dnu a ve vodním sloupci jsou rovnoměrně v malém množství zastoupeny jak sinice, tak zelené řasy. Rozložená biomasa poslouží jako významný zdroj živin pro rozvoj vodního květu v následujícím roce. 

Další informace o FluoroProbe lze získat na stránkách výrobce bbe-Moldaenke (Kiel, Německo). Podobné ponorné fluorescenční sondy na stanovení chlorofylu vyrábějí samozřejmě i další firmy, např. Turner Designs, Ysi nebo Chelsea Technologies Group. Podrobné informace o nich rovněž naleznete na jejich webových stránkách.