Měření fluorescence fotosyntetických pigmentů

Princip metody

Fotoautotrofní organismy využívají za účelem produkce organických látek energii fotonů absorbovaného světla. Tato energie však není fotoautotrofními organismy plně využita pro průběh fotosyntetických reakcí. Část přebytečné energie je vyzářena do okolí jako teplo, další část je pak emitována jako tzv. fluorescence. Fluorescence je popisována jako fyzikální jev, kdy absorpce fotonů světla určité vlnové délky molekulou fluoreskující látky vyvolává emisi fotonů o vyšší (tj. energeticky méně bohaté) vlnové délce. Měření fluorescence chlorofylu může být využito k nepřímé kvantifikaci fytoplanktonu ve vzorcích z vodního prostředí. Při metodě měření indukované fluorescence chlorofylu se využívá navíc faktu, že fluorescence chlorofylu se v průběhu času mění v závislosti na probíhající fotosyntéze a lze tak pomocí jejích charakteristik popsat stav fotosyntetického aparátu sledované řasy nebo sinice.

Fotosystém II (PS II) fotoautotrofních organismů je tvořen chlorofylem-a a dalšími přídatnými pigmenty (chlorofyl-b, fykocyanin, fykoerythrin, fukoxantin, peridinin atd.), které pomáhají zachycovat světelnou energii a předávají ji na chlorofyl-a. Tyto pigmenty jsou specifické pro jednotlivé skupiny fytoplanktonu a liší se schopností absorbovat fotony různých vlnových délek viditelného světla. Fytoplanktonní organismy lze podle barvy jejich pigmentů rozdělit do několika skupin: "modrá" (sinice), "zelená" (zelené řasy), "hnědá" (rozsivky, obrněnky), "červená" (ruduchy) a "smíšená" (skrytěnky). V případě excitace světlem o vhodné vlnové délce většina pigmentů vyvolá díky přenosu zachycené energie emisi fluorescence z molekuly chlorofylu-a, některé pigmenty však vykazují i vlastní fluorescenci. V případě optimální konfigurace měřících přístrojů může fluorescence pigmentů podat nejen informaci o celkovém množství chlorofylu-a, ale i o poměrném zastoupení jednotlivých skupin fytoplanktonu v měřeném vzorku a při použití metody indukované fluorescence chlorofylu také o fyziologickém stavu fytoplanktonu, především o aktivitě jeho fotosyntézy. Hlavní výhodou měření fluorescence je rychlost a snadnost. Měření není destruktivní a může být prováděno opakovaně jak v laboratoři, tak i v terénu.

FluoroProbe, BenthoFluor, BenthoTorch

Na našem pracovišti používáme sondy od firmy bbe Moldaenke GmBH (Kiel, Německo): ponornou sondu FluoroProbe pro měření ve vodním sloupci a sondy BenthoFluor a BenthoTorch pro měření na površích. Všechny sondy využívají pro excitaci LED diody různých vlnových délek (v případě FluoroProbe např. 370 nm, 470 nm, 525 nm, 570 nm, 590 nm a 610 nm). Emise je měřena při fixní vlnové délce 680 nm. Na základě excitačních spekter je možno rozlišit ve vzorku následující skupiny fytoplanktonu: zelené řasy, sinice, obrněnky a rozsivky, skrytěnky. Množství biomasy je automaticky přepočítáváno na μg chlorofylu-a/l. Výrobce uvádí detekční limit 1 μg/l. Horní mez detekce, jsou-li ve vzorku dominantní skupinou sinice, je podle našich zkušeností kolem 50 μg/l. Sondu FluoroProbe je možno využít na stanovení objemu biomasy fytoplanktonu ve vodě a to jak v laboratoři (pomocí kyvetového nástavce), tak i in situ ve vodním sloupci nádrže (až do hloubky 100 m v závislosti na délce měřícího kabelu) nebo vodního toku. Pomocí sond BenthoFluor a BenthoTorch je možno stanovovat nárosty fotoautotrofních společenstev na různých površích – fytobentosu na sedimentech dna a ponořených kamenech, suchozemských nárostů na povrchu kamenných nebo betonových staveb, památkových objektů, nebo kůře stromů apod.

Spektro(fluoro)metrické readery Tecan Sunrise a Genios

Jedná se klasické spektrofotometry od firmy Tecan (Maennedorf, Švýcarsko) s volitelnými vlnovými délkami světla, které jsou schopné měřit optické veličiny jako absorbance a transmitance (Sunrise) a nebo fluorescence a luminiscence (Genios). Oba spektrofotometry jsou přizpůsobené pro měření velkého počtu vzorků v mikrotitračních destičkách (96 jamek).

Fluorometry FluorCam 690, AquaPen AP100-C, FL3500 FAST

Tyto tzv. fluorometry (vše Photon Systems Instruments, Brno, Česká republika) slouží k měření indukované fluorescence chlorofylu ve vztahu k fyziologickému stavu fytoplanktonu, především jeho fotosyntetické aktivitě. Na rozdíl od fluorescenčních sond typu FluoroProbe tyto fluorometry nelze využít pro kvantifikaci a třídění skupi fytoplanktonu. Přístroje využívají pro excitaci (resp. indukci fluorescence) pouze 2 typy LED diod, modré (455 nm) nebo červené/červeno-oranžové (590 - 620 nm) podle typu přístroje a použitého nastavení, a zaznamenávají fluorescenci chlorofylu-a při 680 - 690 nm. Všechny tyto fluorometry běžně pracují v režimu PAM (Pulsní Amplitudová Modulace), kdy vedle měřícího excitačního světla pro indukci fluorescence jsou využívány další zdroje záření – slabší aktinické světlo (obvykle modré nebo červené, vlnová délka do 620 nm) a silné saturační světlo (modré, červené nebo bílé, vlnová délka opět do 620 nm). Měření probíhá tak, že vzorek je stále ozařován velmi krátkými a slabými pulsy měřícího světla, které vyvolává stejně krátké záblesky fluorescence (= pulsní modulace, záblesky o délce v řádu jednotek mikrosekund). V průběhu měření se pak podle potřeby vzorek navíc osvětluje aktinickým nebo saturačním světlem, které vyvolá změnu (obvykle zvýšení) intenzity fluorescenčního signálu (= amplitudová modulace). Výsledkem sledování takových změn v čase je kinetika fluorescence chlorofylu, křivka, která má u zdravých vzorků svůj typický tvar a určují se z ní např. hodnota základní fluorescence (F0 – souvisí např. s množstvím chlorofylu-a ve vzorku a množstvím funkčních fotosystémů s připojenými světlosběrnými komplexy), hodnota maximální fluorescence (FM – souvisí zejména s množstvím funkčních fotosystémů) a řada dalších parametrů, u nichž je znám jejich konkrétní vztah k procesům fotosyntézy, především její primární fáze („světelná“ fáze, fáze zachycení fotonů světla a uložení jejich energie do dočasných zásob v energetických sloučeninách ATP, NADPH). Nejčastěji uváděný parametr je právě poměr variabilní fluorescence (tedy rozdílu základní a maximální fluorescence) ku maximální fluorescenci (FV/FM). Jeho hodnota v rozsahu 0.0 – 0.823 udává maximální kapacitu fotosystémů PS II řas a sinic ve vzorku pro zachycování světelné energie (tzv. maximální kvantový výtěžek PS II).

Fluorometry AquaPen (zjednodušený terénní přístroj) a FL3500 (velmi citlivý laboratorní přístroj) jsou vhodné pro měření suspenzí řas a sinic. Fluorometr FluorCam je zařízení typu „fluorescence imaging system“ vybavené kamerou, které umožňuje sledovat změny fluorescence na ploše vzorku, je určen především pro měření fluorescence na listech vyšších rostlin, ale lze jej využít např. i k měření většího počtu vzorků suspenzí řas a sinic napipetovaných v mikrotitrační destičce.

Algae Online Monitor (AOM)

Ve spolupráci s firmou Photon Systems Instruments, Drásov, Česká republika, byl na našem oddělení vyvíjen také přístroj Algae Online Monitor (AOM). Jedná se o zjednodušený PAM fluorometr s průtočnou měřící komorou, který využívá pro excitaci fluorescence střídavě LED diody o 2 vlnových délkách (455 nm a 590 nm), a díky tomu umožňuje jednak rozlišit a kvantifikovat ve vzorku dvě základní nejdůležitější skupiny fytoplanktonu, sinice a zelené řasy, a také stanovit některé základní parametry jejich fluorescence chlorofylu. Přístroj je upraven pro použití in situ v režimu kontinuálního měření. Množství fytoplanktonu ve vzorku je úměrné fluorescenční odezvě, pro výpočet slouží plocha pod křivkou grafu. Detekční limit se pohybuje kolem 300 až 400 buněk Microcystis aeruginosa/ml, což odpovídá přibližně 0,02 μg/l chlorofylu-a. Přístroj byl v reálných podmínkách testován v sezóně 2009-2010 a nyní je běžně dostupným komerčním produktem firmy PSI. Je vhodný pro instalaci např. do úpraven pitné vody, kde sleduje výskyt a složení fytoplanktonu v přitékající vodě a umožňuje rozhodnout o potřebě úpravy technologie čištění.

Publikace CCT k dané problematice:

• Gregor, J., Maršálek, B. (2004): Freshwater phytoplankton quantification by chlorophyll a: a comparative study of in vitro, in vivo and in situ methods. Water Research 38(3): 517-522.
• Gregor, J., Maršálek, B. (2005): A simple in vivo fluorescence method for the selective detection and quantification of freshwater cyanobacteria and eukaryotic algae. Acta Hydrochimica et Hydrobiologica 33(2): 142-148.
• Gregor, J., Maršálek, B., Šípková, H. (2007): Detection and estimation of potentially toxic cyanobacteria in raw water at the drinking water treatment plant by in vivo fluorescence method. Water Research 41(1): 228-234.
• Gregor, J., Jančula, D., Maršálek, B. (2008): Growth assays with mixed cultures of cyanobacteria and algae assessed by in vivo fluorescence: One step closer to real ecosystems? Chemosphere 70(10): 1873-1878.